色谱技术概述及应用

西北农林科技大学

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色谱分离分析技术概述及其应用

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摘要：色谱技术作为分离分析的重要方法之一，是分析化学中最富活力的领域之一，能够分离物化性能差别很小的化合物，是化学领域不可缺的分离分析方法。色谱技术是一项分离分析复杂样品的技术，在我国工业生产中具有广泛应用。本文简述了近些年来提出几种比较流行的色谱概念、基础理论，对分离分析原理和分析仪器、操作步骤以及样品制备要求做了概括，并分析了色谱分离分析技术在实际中的广泛应用及其发展。

关键词：色谱技术；色谱分离；色谱分析方法；色谱原理；应用；色谱样品处理

Chromatography analysis Technical Overview and Applications

Abstract: chromatographic techniques as an important method of separating analysis is to analyze one of the most dynamic areas of chemistry, physical and chemical properties of the compound can be isolated little difference, separation and analysis methods is essential field of chemistry. Chromatography is a separation of complex samples technology, widely used in China's industrial production. This paper describes the recent years presented several popular chromatographic concept, basic theory, the principle

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of separation of analysis and analytical instruments, as well as sample preparation steps required to do summarized and analyzed the chromatographic separation and analysis technology is widely used in practice its development.

Keywords: chromatography; chromatography; Chromatography; chromatography principle; application; Chromatography Sample Preparation

1 色谱技术概念及分类 1.1色谱分析技术

1.1.1色谱分析技术概念及原理

色谱技术在不同的应用领域中有不同的称呼，在分析技术中叫做色谱分析，在分离技术中叫做色谱分离。色谱法（chromatography）又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种物理化学分离和物理化学分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。它利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。所以色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。色谱法体系中的两相作相对运动时，通常其中一个相是固定不动的，称为固定相；另一相是移动的， 称为流动相。在色谱分析过程中，物质的迁移速度取决于它们与固定相和流动相的相对作用力。溶质和两相的吸引力是分子间的作用力，包括色散力、

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诱导效应、场间效应、氢键力和路易斯酸碱相互作用。对于离子，还有离子间的静电吸引力。被较强吸引在固定相上的溶质相对滞后于较强地吸引在流动相中的溶质，随着移动的反复进行与多次分配，使混合物中的各组分得到分离（如图1-1所示）。

图1-1 色谱技术原理

1.1.2 色谱分析技术分类

色谱分析法的分类比较复杂。根据流动相和固定相的不同，色谱法分为气相色谱法和液相色谱法。(1) 气相色谱法的流动相是气体 ，又可分为 ：气固色谱法，其流动相是气体，固定相为固体；气液色谱法，其流动相是气体，固定相是涂在惰性固体上的液体。(2) 液相色谱法的流动相是液体，又可分为液固色谱法，其流动相是液体，固定相是固体。(3) 液液色谱法，其流动相和固定相均是液体。按吸附剂及其使用形式可分为柱色谱、纸色谱和薄层色谱。按吸附力可分为吸附色谱、离子交换色谱、分配色谱和凝胶渗透色谱。按色谱操作终止的方法可分为展开色谱和洗脱色谱。按进样方法可分为区带色谱、迎头色谱和顶替色谱。色谱法的特点：(1) 分离效率高。可分离性质十分相近的物质，可将含有上百种组分的复杂混合物进行分离。(2) 分离速度快。几分钟到几十分钟就能完成一次复杂物质的分离操作。 (3) 灵敏度高。能检测含量在10-12 g以下的物质。(4) 可进行大规模的纯物质制备。 1.2色谱分离技术

1.2.1色谱分离技术概念及原理

色谱分离是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行的连续多次反复的分配，从而形成差速移动，达到分离目的的方法。色谱分离技术是基于不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，在采用流动相洗脱过程中呈现不同保留时间，从而实现分离。传统色谱分离技术采用固定的色谱塔进行，先进入一定量物料，然后采用洗脱剂不断洗脱，在同一出口在不同时间段就可接到不同的产品组分，此过程费时费力。经过分析并加以改进，我们把固定相的树脂做成可以连续流动的系统，利用物质与固定相的相对运动速度不同实现分离。类似龟兔赛跑的原理，我们把固定相比成一个传送带，把兔子乌龟分别比成快慢不同的两组份，只要使固定相加上一个与洗脱方向相反的驱动力，使传送带运动速度处于兔子和乌龟速度中间，跑的快的兔子比固定相快从前头得到，跑得慢的乌龟被传送带带到后面得到。

1.2.2色谱分离技术分类及特点

色谱法简单分为气相色谱法、液相色谱法、超临界流体色谱法。根据气相和液相制备的不同，再分为填充柱色谱法、毛细管色谱法、经典液相色谱柱法、高效液相色谱法、薄层色谱法、紫色普法、毛细管电泳法。按照固定相与流动相状态具体分类如下表1-1： 色谱属性 液相色谱 固定相 固体 液体 流动相 液体 液体 类型 液—固色谱 液—液色谱 --完整版学习资料分享----

-----WORD格式--可编辑--专业资料----- 气相色谱 固体 液体 气体 气体 气—固色谱 气—液色谱 表1-1 固定相与流动相状态具体分类 无论怎么分类，都有共同的特点：(1) 凡是色谱分离都具有固定相和流动相。(2) 固定相是不动的，流动相相对于固定相做相对运动。(3) 被分离的组分与流动相和固定相都有不同的作用力。这种作用力有吸附力、溶解力、离子交换能力等。在色谱分析中常用分配系数来描述组分对流动相和固定相的作用力的差别：

K=Cs/Ca

由此可见，分配系数的差别性是能够分离的基本原因。 2色谱技术的发展及动力学理论 2.1色谱技术发展

早在本世纪初，俄国植物学家Tswett研究植物色素的组成时，就首先提出了色谱法这一概念，并且认识色谱法为分离技术的潜力。然而遗憾的是，除了几例吸附色谱法分离某些天然产物之外，色谱法并未引起人们足够的重视，而被隔置许多年。1931年，Lederer 和 Kuhn Winterstein的工作进一步表明了色谱法作为一中化工分离技术的潜力。接着是Zec hmeisrer 和 Cholnoky， strain以及 Karrer 和Strong，他们用色谱法分离出克量级的植物色素混合物（叶绿素、 叶黄素、 叶红素）以及其他的天然产物（例如辣淑红等）。自此色谱分离技术才引起各国科学家的足够重视。1941年Martin 和 Simge 提出了分配色谱的概念。并巧妙地把描述分馏过程的塔板理论移植并应用色谱过程，获得了很大的帮助。他们还指出使用小颗粒填料和高的移动相压力，还可以改善液相色谱的效能。并且还预言，液相色谱的流动相可用气体所代替，这不仅大大促进了液相色谱的发展，同时也为气相色谱的出现奠定了基础。虽然Martin 和 Simge 早在40年代初就预见性的指出，液相色谱的流动相也可 用气相所代替，但是一直到1952 年 James 和 Martin 才发表第一篇有关气相色谱的论文。自此，气相色谱才引起人们的高度重视，得到了卓有成效的发展。目前气相色谱的技术已达到相当完善的程度，在石油、化学、化工、生物、医学、食品等各行各业中得到了广泛的应用。气相色谱的产生，可以说是色谱技术的一项革命性的发展。但是应用气相色谱技术只能分析分离能够气化的物质，或者在分析温度下具有足够蒸气压的物质。对于非挥发性的物质、热敏性的物质，以及具有生物活性物质分析分离，气相色谱技术将无能为力。为了根本上解决气相色谱技术的不足之处，高效液相色谱( HPLX )就应运而产生了。 2.2色谱动力学理论

从四十年代起，随着液相色谱技术的发展，许多研究者对色谱基础理论进行了不懈的研究， 提出了众多理论。其中比较著名的有：平衡色谱理论、塔板理论、轴向扩散理论、速率理论、双膜理论等。

2.2.1 平衡色谱理论

早在1940年，Wilson就提出来了平衡色谱理论，随后DeVault 等人应用这一理论解释实验现象，使这一理论得到了进一步发展。此理论认为在整个色谱过程中，组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬时达成。平衡色谱理论能很好地解释实验过程中谱线的移动速度，以及非线性等温线时的流出曲线形状。但是，由于这一理论忽略了传质速率的有限性与物质分子轴向扩散性的影响，因而不能解释线性色谱条件下的区域扩张现象。 2.2.2塔板理论

1941年，Martin和 Synge在提出分配色谱的论文中，阐述了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，提出了色谱的塔板理论。在这一理论中，他们将色谱过程比拟为蒸馏过程，把色谱看成是由一系列平衡单元一理论塔板所组成。在每一个塔板高度内，组分在流动相和固定相之间的分配平衡能瞬时达成。在色谱柱足够长，理论塔板高度足够小，以及线性等温线的条件下，塔板理论可以对色谱流出曲线分布、谱带移动规律以及柱长与理论塔板高度对区域扩张的影响等给予近似的说明。但是塔板理论对影响理论塔板高度的各种因素没有从本质上考虑，因而这一理论只是半经验的理论，不

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能揭示色谱过程的本质。尽管如此，塔板理论对于色谱早期理论的发展，还是做出了宝贵的贡献。而且，由于塔板理论能简单明地说明柱效，所以仍为大多数色谱研究者所接受。 2.2.3轴向扩散理论

为了进一步揭示色谱过程的本质， Amundson 等人通过大量实验，提出了色谱的轴向扩散理论。这个理论认为，在色谱过程中，组分在流动中的轴向扩散是影响色谱区域谱带扩张 的主要因素，而有限的传质速率对区域谱带扩张没有影响。当传质速率较快而轴向扩散为区域扩张的主要因素时，轴向扩散理论具有较好的指导意义。例如，在气相色谱中，当流动相的流速较低，且柱温较高时，轴向扩散理论能很好地解释实验结果。 3色谱技术在生产中的应用 3.1 精细化工领域

目前在精细化工研究领域，产品的精细分离与含量测定越来越严格，同时规模化的生产也对成本核算和质量要求越来越苛刻，所以，如何高效分离分析化工产品各组分成为一个严峻的课题随着色谱分离技术研究的不断深入，尤其集成化和规模化色谱分离技术的应用，使得色谱分离技术在精细化工领域应用越来越广泛，尤其在发掘工业生产过程中，色谱分离技术尤为重要在发掘工业领域，发酵液成分复杂，杂质多样，而目标样品往往含量较低，如何实现目标成分的高效分离分析，对于该行业的发展起着关键作用在发酵工业中，目前应用较为广泛的色谱技术主要是离子交换技术，主要针对发酵液中离子含量复杂多样利用离子交换柱，目前常见的分离样品主要包括味精生产，淀粉生产，麦芽糖生产，醇类生产等等。 3.2医药领域

随着医药现代化生产的不断发展，对于医药组分的分离与单一成分研究要求越来越高但由于药学成分提取复杂，有效成分含量较低等原因，因此需要更为严格的分离分析手段进行药效成分的分离和含量测定目前在医药成分分离分析领域主要应用到的色谱技术主要包括薄层色谱，气相色谱和毛细管电泳技术而随着现代分析仪器的不断发展，尤其中药及天然药物药效成分组成极其复杂，对其分离要求也愈发严格，需要发展更为精密的色谱技术，如超临界色谱，高效逆流色谱，高效毛细管电泳和色谱-质谱联用技术赵君奎等利用高效液相色谱技术首次分离测定了中药植物月腺大戟中抗结核有效成分狼毒甲素和狼毒乙素，对其质量评价和药效成分分析起到了关键作用吴波利用灵敏度较高的高效液相与FCD联用技术分离并测定了中药葛根中葛根素的含量，发现其样品回收率达到较高水平，而相对偏差分析结果显示其精度较高，结果较为可靠，适合葛根素分离分析的大规模生产在含有皂苷成分的中药组分分离过程，极性较大皂苷成分结构非常复杂，皂苷分离难度较大，根据目前国内外研究进展，采用高效液相色谱与ELSD联用分离较为理想。 3.3蛋白质组学研究

色谱技术除了在工业生产中有着广泛的应用之外，在微观大分子分离领域也有着重要的应用例如蛋白质组学研究中，色谱分离技术也有着重要应用目前对于蛋白质组的分离研究，主要有双向电泳技术和高效液相色谱技术其中双向电泳技术根据蛋白质的分子量及等电点在二维领域将蛋白质进行分离，可以直观显示生物体内的蛋白质组成，双向电泳结合质谱技术已成为蛋白质组学研究的一个成熟的研究平台虽然双向电泳技术在蛋白质研究中具有高灵敏度和直观性强等优点，但同时它有着难以克服的缺点，如结果分析复杂，成本较高，信息量大以及电泳前的样品准备复杂等缺点为了解决双向电泳技术的这些缺陷，高效液相色谱技术被引进用于蛋白质组学研究，尤其各种模式的色谱技术的联用，使得色谱分离技术在蛋白质组学中的应用发挥了其自身的天然优势。 4 色谱技术使用步骤及样品制备、注意事项 4.1高效逆流色谱分离分析复杂蛋白质

高速逆流色谱仪(High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)，于1982年由美国国立卫生院Ito博士研制开发的一种新型的、连续高效的液液分配色谱技术。高速逆流色谱(HSCCC)是一种液-液色谱分离技术，它的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，具有样品无损失、无污染、高效、快速和大制备量分离等优点。由于HSCCC与传统的分离纯化方法相比具有明显的优点，因此此项技术己被广泛应用于中药成分分离、保健食品、生物化学、生物工程、天然产物化

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学、有机合成、环境分析等领域。我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家。张天佑等在国内首先自行研制了分析型和制备型的高速逆流色谱仪，对我国中药功能成分的分离制备取得了显著成果。上海同田生化技术有限公司生产的高速逆流色谱仪，分离中药成分纯度达到99%，可用于HPLC检测标准样。

蛋白质产品在食品营养品药物医学诊断及生物催化等领域的广泛应用，蛋白质的分离纯化方法的研究成为生物技术研究领域的热点高速逆流双水相色谱法是高效高收率分离生物大分子的重要途径，可有效地应用于分离纯化蛋白质样品，具有较高的分辨率和稳定性在生物大分子的分离纯化中，有机溶剂通常会使生物大分子细胞的结构及性质发生不可逆变化 双水相体系的条件温和( 含水量高达70%～90%) 表面张力低回收率高，特别适用于蛋白质核酸及细胞粒子的提取和纯化由双水相萃取技术与逆流色谱集成而成的双水相逆流色谱技术，结合了逆流色谱的高效率高制备量以及双水相体系适于蛋白质分离的特点，避免了由固体分离介质可能引起的不可逆吸附失活和变性等问题，因此在蛋白质的分离方面具有独特的应用价值双水相HSCCC体系的建立与仪器设备及操作工艺条件密切相关，利用多分离柱高速逆流色谱仪，研究了PEG1000无机盐双水相体系对标准蛋白质混合物以及卵白蛋白的分离，从而为生物大分子的高效和高收率分离开辟了一条新的途径。 4.2反相高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography，Rp-HPLC)

高效液相色谱( high－performance liquid chromatography，HPLC) 是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次的交换过程，它借溶质在两相间分配系数亲合力吸附能力离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进行分离在HPLC各种模式中，ＲP－HPLC应用最为广泛 其固定相是非极性的，而流动相是比固定相极性更强的溶剂系统蛋白质分子疏水性的不同使其在两相中的分配不同而得到分离近几年来，ＲP－HPLC以其高分辨力快速重复性好等优点广泛应用于蛋白质的分离分析。有利于蛋白质分离的条件于1970年首次提出，即低pH值流动相室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分三氟乙酸(TFA) 作为离子对试剂，是反相色谱中最常用的添加剂蛋白质的保留指数和选择性还与键合固定相的性质有关，实验证明，大孔硅胶( 20～30 nm) 短链烷基( C4 和C8) 键合固定相适合蛋白质的分离; 而无孔径载体柱对分子量相差较大和疏水性很强的蛋白质混合物的分离效果很好，从分子量6000的胰岛素到分子量66000的牛血清白蛋白均能得到良好的分离，并且分离速度很快( 一般2～5 min)；较高的柱温还能改善蛋白质混合物的分离。利用C18非多孔硅粒载体柱实现了细胞溶菌物中蛋白质的快速分离利用这种方法，在15 min内就可以很好地分离大肠杆菌的整个细胞溶菌物水溶液中的蛋白。 5 常见液相气相色谱注意事项 5.1 液相色谱注意事项

液相色谱仪器使用步骤以及注意事项：(1) 流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45 um或更细的膜过滤)。(2) 流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使。(3) 不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40 min以上，以充分洗去离子对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。(4) 长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。(5) 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器 。C18柱绝对不能进蛋白样品，血样生物样品。(6) 堵塞导致压力太大，按预柱混合器中的过滤器管路过滤器单向阀检查并清洗清洗方法；以异丙醇作溶剂冲洗：放在异丙醇中间用超声波清洗；用10％稀硝酸清洗 。(7) 气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。(8) 如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗 。(9) 要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的流动相中更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 5.2 气相色谱使用注意事项

(1) 先通载气，后通电；先关电，后关载气。当连续使用或做精细分析时，晚上最好不关载气，可适当调低入口压强至0.1 MPa，保证系统内的正压状态。当TCD高温运行结束后， 应关热导控

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制器和温度控制器半小时后才能关载气，以保护传感器元件不被高温氧化；(2) 当第一次使用气瓶减压阀时，请将减压阀原出口接头取下，用附件箱中的接头(CF8.470.080)替代。用Φ3×0.5软管连接减压阀、净化管及仪器，减压阀和净化管接头连接处必须保证不漏气；(3) 开气源时，气瓶开关阀应开足，减压阀开关旋至最松，查看减压阀的压力表应压力足够，然后逐渐调减压阀，仪器正常运行时， 使减压阀低压测压强输出为：载气在0.5～0.6 MPa之间；氢气、空气在0.3～0.4 MPa之间。若压力过大会损坏仪器内部阀件，甚至引起净化管炸裂；若压强过小，稳压阀不能正常工作，须调至规定范围内；(4) 仪器的载气稳压阀出厂时已校准至0.4 Mpa，一般情况下用户不要自己调整，以免流量表不准确，若调动，载气流量需重新校正；(5) 接入检测器的色谱柱必须事先经过严格老化，其老化温度低于固定相的最高使用温度，高于分析样品时的温度，老化时间应长于36 h，并通以适当的流量，以避免分析时固定相流失引起检测器污染和基线漂移。若用柱箱老化色谱柱，柱出口不能接在检测器上，应使其出气排出仪器外；(6) 用氢气作燃烧气的检测器工作温度应不低于120 ℃，并且应达到该温度才可点火，否则会因燃烧后生成的水汽积水，严重影响检测器的使用寿命和性能，关机时也应先关辅助气，待氢气、空气压强降至零，火熄灭后方可降温；(7) 稳流阀使用中不宜将流量调得过小(接近零)，以免损环其阀针，刻度旋钮调节时不要太快，并认准每次是一种旋向(顺或反时针)，以保证流量的重复性；(8) 通电使用中不能拆接任何电气部件，若需维修，必须关电后再操作，并且应搞清楚毛病后再进，轻易不要随便拆换元器件，以免扩大故障范围；(9) 汽化室用进样密封片，在注射10～20次后，应及时更换，以免漏气。进样垫使用前应先在苯或酒精中浸泡清洗半小时，然后在220 ℃下烘干备用。 6 色谱技术应用展望

色谱法分离效率高，选择性好，在分离纯化生物大分子的过程中是不可缺少的方法。蛋白质的分离纯化技术无论在分子生物学领域，还是在生物化学领域都占有很重要的地位，而单靠一种色谱技术已经不能完全满足生产和实验的需要，蛋白质的分离纯化技术的发展趋势日益转向多种技术的联合应用。还有近年来发展起来的分离纯化蛋白质的新色谱技术。目前在色谱技术发展过程中，有越来越多的更新与发展，出现了各式各样的色谱技术，他们各自都具有自身独特的优势，未来在不同的应用领域，根据自身特点，可以制定相应的生产策略，选用适合自身的色谱技术。同时，在对分离分析越来越高的工业生产中，还应该注意将不同色谱技术进行不同的优化组合，探索适合自身企业生产的色谱组合模式，使生产达到效率的最大化。最后，色谱技术即使现在已经有了长足的进步与发展，但色谱分离仍然是一项较为复杂的技术，仍然有着较大的创新发展潜力，尤其在交叉学科飞速发展的今天，还应根据色谱原理联合不同学科的技术尤其，进行色谱技术的创新发展及不同技术领域的综合应用，创新色谱技术，实现色谱效率的最大化应用。

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